Trata-se de uma revisão atualizada literatura acerca da aplicabilidade de biomoléculas salivares no diagnóstico e monitoramento de enfermidades orais e sistêmicas. A pesquisa bibliográfica foi realizada em uma única base de dados da internet, a PubMed por um único pesquisador devidamente calibrado, a fim de identificar trabalhos que satisfizessem o objetivo do nosso estudo, sendo eles publicados a partir de 2013 até setembro de 2018, utilizando os descritores “saliva”, “biomarkers” e “diagnosis”, com auxílio do operador de busca AND. Houve restrição de linguagem, sendo idioma inglês o de nossa escolha. Não houve restrição quanto ao tipo de estudo. Todos os autores se qualificaram como revisores dos artigos depois de serem devidamente calibrados pelo grupo de iniciação científica da instituição de ensino e participaram da seleção dos estudos a partir da busca inicial. O índice Kappa entre os seis revisores que fizeram a pesquisa foi de 0,764.

Inicialmente 245 estudos foram encontrados e 39 foram selecionados a partir da leitura do título. Após isso, os artigos seguiram para leitura do resumo, onde foram selecionados 32 estudos. Em seguida, após leitura completa, 15 artigos foram excluídos por não estarem dentro dos requisitos estabelecidos na pesquisa (especificação e sensibilidade dos biomarcadores e/ou clareza nos métodos e técnicas utilizadas para o diagnóstico) ou não relacionados ao escopo de nosso estudo. Por fim, um total de 17 estudos^{(3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19)} seguiram os critérios de elegibilidade e foram mantidos para análise qualitativa. Fluxograma do processo de busca e seleção bibliográfica

A análise da saliva como abordagem diagnóstica para doenças sistêmicas foi proposta há duas décadas. Contudo, o grande interesse na área surgiu recentemente devido ao seu potencial como biópsia líquida. A saliva é chamada de espelho do corpo por ser considerada um ultrafiltrado do sangue e porque sua composição muda sob diferentes condições patológicas.⁽¹³⁾

De acordo com Korte,⁽²⁰⁾ proteínas plasmáticas encontradas na saliva têm despertado interesse dos estudiosos, por cerca de 40% dessas representarem biomarcadores para inúmeras patologias, como o câncer, doenças periodontais, doenças cardiovasculares e endócrinas, além de desordens autoimunes e afecções virais. Isso acontece porque as glândulas salivares e seus lóbulos internos altamente permeáveis estão em íntimo contato com capilares sanguíneos que, por sua vez, extravasam moléculas proteicas que são absorvidas por células glandulares e, posteriormente, secretadas como saliva na cavidade oral. Essa troca livre de moléculas de proteína derivadas do sangue no fluido oral permite a detecção precoce e o monitoramento de doenças orais e sistêmicas.

O diagnóstico de casos de câncer ainda é, em grande proporção, realizado em estágio avançado devido a uma ampla variedade de razões, como por exemplo as socioeconômicas e médicas.⁽²¹⁾ Desse modo, é válido considerar as novas ferramentas de diagnóstico que podem melhorar o diagnóstico do câncer e o monitoramento da doença, consequentemente, a melhoria em relação à sobrevida do paciente. A tabela 2 apresenta a relação das neoplasias malignas evidenciadas neste estudo e as demais patologias diagnosticadas, seguidas das biomoléculas empregadas para realização da técnica.

Tabela 2. Distribuição da relação das patologias diagnosticadas e seus biomarcadores

Neoplasias malignas

A maioria das neoplasias de mama são detectadas em estágio avançado, resultando em taxas altas de mortalidade. O exame de rastreamento pela mamografia é o padrão ouro para o diagnóstico, mas nem sempre é possível obter resultados concretos, a depender da mamografia. Com isso, o uso de biomarcadores salivares pode ser utilizado para detectar estágios precoces de câncer de mama. Concentrações da proteína CA15-3 foram verificadas em pacientes com câncer em comparação ao grupo controle, e sua presença pode ser usada para monitorar possíveis casos de metástase da neoplasia.⁽¹⁶⁾

Evidências científicas revelaram que várias proteínas salivares estão alteradas em pacientes com câncer bucal, incluindo Cyfra 21-1, TPS e CA12, vários parâmetros salivares relacionados ao estresse oxidativo e parâmetros bioquímicos e imunológicos. A hipermetilação do promotor de DNA na saliva de pacientes com câncer bucal também se mostrou útil para o diagnóstico precoce dessa doença sendo possível sua aplicabilidade em ambiente clínico.^(11,18)

A presença de microRNAs, principalmente o miR-31, foi expressivamente aumentado na saliva de pacientes com carcinoma oral em todos os estágios clínicos, incluindo tumores muito pequenos. No entanto, nenhuma diferença na expressão de miR-31 salivar foi encontrada ao comparar pacientes com leucoplasia verrucosa oral em relação aos controles. Ao comparar a expressão de miR-31 em diferentes fluidos corporais, eles descobriram que o miR-31 era mais abundante na saliva do que no plasma, sugerindo que o miR-31 salivar era um biomarcador mais sensível para malignidade oral.^(6,10)

Foi relatado que o aumento no antígeno tumoral CA15-3 e anticorpos para os marcadores de proteína tumoral c-erbB2, CA-125 e P53 na saliva também podem ser considerados biomarcadores salivares para cânceres da cavidade oral e outros locais. Além disso, estudos mostraram que hialuronidase, interleucina 6 (IL-6) e interleucina 8 (IL-8), podem ser biomarcadores potenciais para pacientes com carcinoma espinocelular de cabeça e pescoço.^(4,10,12,17)

Com relação ao câncer de pulmão, Zhang et al. ⁽¹⁰⁾ realizou estudos de microarranjos confirmando a especificidade de mRNA para essa condição. Estudos apontam que os níveis de três proteínas (haptoglobina, AZGP1 e calprotectina humana) foram significativamente maiores entre os pacientes com câncer de pulmão em relação aos grupos controles saudáveis.^(10,13,16)

Pesquisa sobre análises dos níveis de antígeno prostático específico (PSA) em três grupos: pacientes com câncer de próstata, pacientes com hiperplasia prostática benigna e indivíduos saudáveis relatou significativa diferença entre os pacientes com doença prostática (benigna ou maligna) e o grupo controle encontrado apenas para os níveis de PSA livre no soro, os níveis de PSA total e as relações livre/total de PSA. Não foi observada correlação significativa entre os níveis de PSA salivar e sorológico entre os grupos, sugerindo que mais estudos são necessários para descobrir adequados biomarcadores salivares para detecção de câncer de próstata.⁽¹³⁾

Biomarcadores salivares transcricionais foram associados com câncer pancreático, sendo utilizado um modelo que incluiu quatro mRNAs (KRAS, MBD3L2, ACRV1 e DPM1) com 90 % de sensibilidade e 95 % de especificidade. Assim, estes biomarcadores poderiam discriminar pacientes com e sem câncer pancreático. A alta sensibilidade e especificidade sugerem que esses biomarcadores podem ser úteis para a realização de teste de rastreamento para esse tipo de câncer.^(10,13,17)

Em monitoramento salivar de pacientes com leucemia com ou sem tratamento antineoplásico em nível imunológico, bioquímico e hormonal, observaram que, independentemente do tratamento, os níveis de fosfatase alcalina salivar (ALP) foram mais significantes no grupo de câncer do que no grupo controle. No entanto, as concentrações de ureia foram menores em pacientes tratados em comparação com os não tratados e os grupos controles. Assim, foi colocado que o tratamento antineoplásico aumenta os níveis de glicose e diminui as concentrações de insulina, reforçando o valor da saliva como ferramenta de monitoramento no tratamento do câncer.⁽¹³⁾

Wang et al.⁽¹⁶⁾ mostrou que mais de 500 proteínas foram identificadas e quantificadas para serem biomarcadores salivares do câncer de estômago, entre as quais 48 apresentaram um perfil diferencial de expressão, que foi significativo entre os pacientes controle e pacientes com a neoplasia. Cistatina B, triosofosfato isomerase e a Deleted In Malignant Brain Tumors 1 (DMBT1) foram verificados com sucesso pelo teste Enzyme Linked ImmunonoSorbent Assay (ELISA). A combinação desses três biomarcadores pode atingir 85 % de sensibilidade e 80 % de especificidade no diagnóstico desse tipo de neoplasia.

Doenças periodontais

Os biomarcadores específicos para doenças podem ser usados ​​na determinação de riscos, no planejamento do tratamento e na progressão da doença.⁽⁵⁾ Além das doenças orais, como a periodontal, a saliva também pode ser vista como potencial ferramenta para o diagnóstico de doenças sistêmicas. Como existe uma associação entre periodontite crônica e doenças cardiovasculares, um ultrassensível sistema de ensaio microchip para determinar Proteína C reativa (PCR) salivar tem sido sugerida para o diagnóstico. Perfis de proteômica salivar em pacientes com periodontite e indivíduos saudáveis, mostraram mudanças distintas nas proteínas presentes de inflamação, que pode levar a melhora do diagnóstico da doença periodontal.⁽⁷⁾

Biomarcadores na saliva têm sido encontrados na doença periodontal por meio das fases da doença: inflamação induzida pela infecção, degradação do colágeno e reabsorção óssea. No tecido periodontal infectado, inúmeras citocinas são liberadas devido à resposta imune pelas células presentes naquele tecido, ­­­entre elas a interleucina-1beta (IL-1β), citocina muito relevante e indicativa de periodontite. Além disso, metaloproteinases do indivíduo são responsáveis por iniciar o processo de degradação da matriz extracelular, relacionada à periodontite. A MMP-8, especialmente, é uma enzima liberada pelos neutrófilos que atua na quebra de colágeno, e tem um grande potencial para ser um biomarcador da periodontite, onde vários estudos mostram que há um aumento no número dessa enzima em pacientes que possuem doença periodontal, comparado aqueles pacientes saudáveis.^(8,9,10)

A predominância de Imunoglobulina A (IgA) na saliva, pode indicar um risco aumentado de o paciente apresentar doença periodontal, devido ao fato de que esta imunoglobulina está relacionada com a defesa contra as bactérias periodontopatogênicas, interferindo na adesão e metabolismo das mesmas. Os níveis de IgA encontrados na saliva de pacientes com doença periodontal estavam exacerbados, enquanto que em pacientes saudáveis os níveis eram significantemente mais baixos.⁽¹⁵⁾

Em contrapartida e ainda de acordo com Güncü et al.⁽⁸⁾ há limitações quanto ao uso dos biomarcadores salivares para o diagnóstico prévio da doença periodontal. Segundo ele, esses peptídeos fazem parte da resposta inicial do tecido quanto à infecção e isso pode ajudar no diagnóstico prévio da doença, porém deve-se levar em conta que eles podem, dependendo da sua concentração, se agregar e dificultar a sensibilização do método, além disso, é possível que enzimas bacterianas e até do próprio indivíduo degradem os peptídeos antimicrobianos que seriam utilizados pelo método, e por fim, alguns peptídeos podem se acumular no tecido e não serem liberados na saliva, podendo dar um teste falso-positivo sobre o caso.

Doenças autoimunes

Há uma necessidade científica muito grande em conseguir detectar a Síndrome de Sjögren (SS) precocemente, pois seus sintomas só aparecem quando a doença já está num estágio avançado. Biomarcadores salivares podem atuar nesse diagnóstico prévio e de uma forma não invasiva. Recentemente moléculas características de biomarcadores vem sendo investigadas, e entre elas estão a interleucina-4 (IL-4), interleucina-5 (IL-5) e a clusterina. Foi verificado que pacientes portadores da síndrome apresentavam uma discrepância de valores em comparação com pacientes saudáveis.^(10,15)

Apesar dos resultados controversos, a revisão realizada por Humberto ⁽¹⁹⁾ sugere que os pacientes com Líquen Plano Oral (LPO) tem um aumento da resposta inflamatória, como indicado pelo perfil pró-inflamatório salivar das citocinas. Além disso, as medições da citocina salivar e o óxido nítrico podem ter um potencial significativo no diagnóstico e prognóstico para monitoramento da atividade da doença e respostas terapêuticas no LPO, bem como para a descoberta de alvos dessa doença.

Todos os estudos incluídos relataram aumento do óxido nítrico salivar em pacientes com LPO, o que hipoteticamente resulta do aumento dos níveis de IL-6, Fator de Necrose Tumoral-Alfa (TNF-α) ou IL1-ß produzidos por linfócitos T e macrófagos. Em relação ao método de detecção de óxido nítrico salivar, o teste de Griess foi o método utilizado nos estudos incluídos nessa revisão. O óxido nítrico salivar parece ser um marcador promissor para estudos sobre patogênese do LPO.⁽¹⁹⁾

Doenças bacterianas

O uso de diagnósticos salivares para avaliação de risco de cárie inclui abordagens de microbioma, proteômica, genômica e transcriptômica. Os patógenos associados à cárie dental humana mais comuns são Streptococcus mutans (S. mutans), Streptococcus sobrinus (S. sobrinus) e lactobacilos. Baixos níveis salivares de alfa-defensinas HNP1-3 contribuem para a suscetibilidade à cárie em crianças, enquanto mucinas salivares promovem a aglutinação de estreptococos. A avaliação do risco de cárie também pode ser gerenciada por meio da análise dos fatores relacionados ao hospedeiro na saliva, incluindo taxa de fluxo salivar, pH salivar e capacidade tampão. Ferramentas diagnósticas incluem métodos baseados em cultura, como mitis salivarius bacitracin (MSBB), métodos dip-slide, bem como novas tecnologias moleculares emergentes como hibridação de ADN-ADN, impressão de genomas digitais, clonagem e sequenciação do gene 16S rRNA, T-RFLP e sequenciação de DNA, incluindo análise de dados de genoma bacteriano.⁽¹⁴⁾

Concentrações aumentadas de populações bacterianas na saliva podem indicar um aumento no risco de cárie do paciente.⁽¹⁵⁾ A presença de S. mutans na saliva pode ser um indicativo sobre a colonização precoce e o surgimento da doença cárie, porém isso é um indicativo altamente variável na detecção precoce da doença, uma vez que ela é considerada multifatorial e necessita de outros fatores para o seu desenvolvimento. Assim como os lactobacilos, sua indicativa de cárie é incerta, uma vez que os níveis microbianos podem estar elevados pelo fato da dieta do paciente.⁽¹⁷⁾

Em outro estudo com indivíduos do sexo feminino suscetíveis e resistentes à cárie (20 a 21 anos), verificou-se que as concentrações lipídicas na saliva parótida em indivíduos suscetíveis à cárie foram maiores do que nos resistentes à cárie e diferenças nas composições ácidas também foram encontradas. Assim, as variações nos níveis lipídicos e composição de ácidos graxos podem estar associadas no desenvolvimento de cárie.⁽¹¹⁾

Doenças virais

A saliva pode ser utilizada como diagnóstico auxiliar do HIV 1 e 2 a partir da concentração de Imunoglobulina G (IgG) presente nela. Ao verificar pelo ELISA, pode-se perceber se a concentração da Imunoglobulina está alterada, e com isso solicitar outros exames para conseguir uma confirmação exata do diagnóstico. Em adição, estudos recentes têm revelado que anticorpos e/ou antígenos de Hepatite A, B e C poderiam ser encontrados em amostras de saliva de pacientes infectados.⁽³⁾

Zhang et al.^{( 10)} afirmam que no nível proteômico existem testes de anticorpos baseados em saliva que podem detectar vírus, incluindo vírus da hepatite A, vírus da hepatite B, vírus da hepatite C, HIV-1, vírus do sarampo, vírus da rubéola e da caxumba vesicular, entre outros. Além disso, em um novo teste salivar denominado Teste Rápido de Anticorpos do vírus da hepatite C (OraQuick) pode-se detectar o vírus da hepatite C de maneira mais fácil e rápida. Em adição, o RNA do vírus da dengue e os antígenos não estruturais da proteína 1 também são detectáveis ​​a partir da saliva, o que pode fornecer uma maneira mais eficaz de diagnosticar a dengue. Outras PatologiasOutra série de patologias podem, ainda, ser identificadas por meio do conteúdo salivar, como doenças cardiovasculares e acidente vascular cerebral (AVC). Estudos mostram cerca de 40 % das proteínas plasmáticas que são marcadores específicos para essas condições (mioglobina, mieloperoperidasina e creatinofosfoquinase) estão presentes na saliva,^(4,17) e que a alfa-amilase salivar foi relatada como um fator diagnóstico independente para infarto agudo do miocárdio (IAM) em pacientes sofrendo de dor peitoral com período inferior a 4 h.⁽¹⁷⁾ Em adição, o IAM foi predito por uma combinação de eletrocardiograma e níveis de PCR com 80,0 % de sensibilidade e 100 % de especificidade.⁽¹⁰⁾

Alguns distúrbios endócrinos como a síndrome metabólica e diabetes mellitus tipo 2 também foram capazes de ser diagnosticados por meio da saliva. Isso se deve a expressão de proteínas, moléculas e outros fatores salivares como ácido úrico, lisozima, lactoferrina, albumina, IgA e MMP-9.^(4-17) Já a fibrose cística, doença genética rara, pode ser identificada pela atividade magnética e enzimática, lipídeos e proteínas, cloro, sódio, cálcio e fosfato excretados na saliva das glândulas submandibulares.⁽⁴⁾

Por fim, os transtornos psicológicos como estresse, depressão e anorexia nervosa estiveram associados a níveis mais altos de cortisol, sendo este o biomarcador regular para estas condições.^(10,17) Além disso, o diagnóstico salivar é também usado em algumas doenças neurodegenerativas, como a doença de Alzheimer, onde os níveis de proteínas TAU totais e fosforiladas são mais altos em comparação com indivíduos saudáveis. Também foi notório níveis aumentados de fator de crescimento nervoso (NGF) e neuropeptídeos sensoriais nestes indivíduos.⁽¹⁷⁾

Para o diagnóstico molecular na cavidade oral se faz necessária a descoberta de biomarcadores para várias doenças, sua validação e avaliação de sua sensibilidade e especificidade, além da determinação de um padrão referencial para os constituintes salivares. No entanto, pesquisas sobre a saliva e suas aplicações para o diagnóstico da doença ainda estão em seus estágios iniciais e o progresso desses estudos é limitado pela falta de métodos e técnicas eficientes e úteis. É necessário desenvolver sistemas de identificação molecular salivar e padronizar a sua avaliação.